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    公开号:WO1986006277A1
    申请号:PCT/EP1986/000230
    申请日:1986-04-18
    公开日:1986-11-06
    发明作者:Wulf DRÖGE
    申请人:Deutsches Krebsforschungszentrum；
    IPC主号:A61K31-00
    专利说明:
    [0001] - -7 -
    [0002] Verwendung von L-Ornithin zur Herstellung von M zur selektiven Hemmung von T-Zell vermittelten

    [0003] Ein Hauptproblem bei der Organtransplantation ist das Auf¬ treten von Immunabstoßungsreaktionen. Es besteht daher ein starker Bedarf nach Mitteln, welche diese Immunreak¬ tionen unterdrücken. Eine Zusammenfassung findet sich in Transplantation Proc. Vol. XVII, Nr. 1 und 2 (Feb.1985). Diese Publikation zeigt einen überblick über die bis jetzt bekannten und in der Klinik verwendeten Mittel, insbeson¬ dere auch Cyclosporin A, das sich als das wirksamste Mittel erwiesen hat.
    [0004] Es wurde nun gefunden, daß L-Ornithin eine starke immuno- suppressive Wirkung auf die Aktivierung cytotoxischer T-Lymphozyten (CTL) in vivo und in vitro hat, also die selektive Hemmung der Aktivierung von cytotoxischen T- Lymphozyten Effektorzellen bewirkt.
    [0005] Dies ist überraschend, da diese Hemmwirkung bei den struk¬ turanalogen L-Lysin und Putrescin oder bei den Aminosäuren L-Histidin und L-Alanin nicht zu beobachten ist.
    [0006] Aus der US-PS 43 20 146 und zahlreichen Literaturstellen ist es bekannt , daß Ornithin und Arginin Schutz gegen die toxischen Effekte von Ammoniumsalzen bieten , jedoch ist die Gabe von Ornithin und Arginin als solche bei Patienten wegen deren verminderten Toleranz für Stickstoff beschränkt. Diese Verwendung für Hyperammonämie läßt aber keinen Schluß auf eine selektive Hemmung bestimmter Immun¬ reaktionen zu.
    [0007] Die immunhemmende Wirkung' scheint selektiv auf die Aktivie¬ rung der CTL Precursorzellen ausgeübt zu werden , da L-Orni¬ thin bei den für die -jπmunheiπrπung brauchbaren Konzentrationen keine Wirkung auf viele Typen proliferativer Reaktionen, einschließlich der allogenen mixed ly phocyte Reaktion, der Il-2-abhängigen prolifera- tiven Antwort von Con-A-aktivierten Thy ocyten und der IL-2 -abhängigen Proliferation des W-2 T-Zellklons hat und auch keine Wirkung auf die Erzeugung von Interleukin 2 oder -Interferon durch Con-A-akti vierte - C3H-Milzzellen oder PMA-aktivierte IL-4-Thvmoιratzellen. Folglich ist der immunsuppressive Effekt von L-Ornithin selektiver als der von Cyclosporin A, von dem man weiß, daß es nicht nur die Aktivierung von cytotoxischer Aktivität sondern von proliferativen Reaktionen und die Produktion der Ly phokine IL-2 und ^Interferon hemmt und unterdrückt. Demnach haben L-ornithinhaltige Mittel Vorteile gegenüber Cyclosporin A, das nicht nur der Ausbildung der cytotoxischen Effektorfunktion sondern auch die proliferative Antwort des T-Cell- Systems und die Induktion der Ornithindecarboxylase- Aktivität hemmt.
    [0008] Ohne an eine Theorie gebunden zu sein könnte folgendes möglich sein. Es ist bekannt, daß durch Antigen oder Mitogene aktivierte Lymphozyten erhöhteintrazelluläre . Spiegel von Ornithindecarboxylase ausdrücken, ein Schlüsselenzym für die Biosynthese von Polyaminen, die für Zellwachstum und Differenzierung erforderlich sind. Daher könnte der äußerliche Zusatz von L-Ornithin zu einem Überschuß an Polyaminen führen oder eine feed-back-Hemmung der ornithinerzeugenden Enzyme (d.h. Arginase) induzieren und hierdurch ein Ornithin- mangel in der Spätphase der Immunantwort geschaffen werden.
    [0009] Die anzuwendenden Mengen betragen, wie aus der Figur 2 ersichtlich ist, etwa 0,1 bis 1 g/kg bei einer Durch- sσhnittsdosis von etwa 0,1 bis 0,2 g/kg, wobei natürlich Abweichungen nach unten und oben möglich sind. Wegen der fehlenden Nebenwirkungen ist die Dosierung von
    [0010] Ornithin wenicrer kritisch als die von Cvc.losnorin A. Die Konzentration von Injektionslösungen kann zwischen 0,1 u. -1 molar sein. Als Träger für die anzuwendenden Präparate eignet sich z.B. physiologische Kochsalzlösung,mit welcher in üblicher Weise sterile Injektionsampullen zubereitet werden können. Das Mittel kann aber auch in Form von oralen Präparaten, z.B. Tabletten oder Kapseln konfektio¬ niert werden, wobei die üblichen, bekannten Hilfsstoffe. 1 für solche Präparate mitverwendet werden können (siehe z.B. Ullmanns Enzyklopäide d. techn. Chemie, 4. Aufl. , Bd. 18, S. 151 - 161 ) .
    [0011] Im folgenden werden die Arbeitsmethoden beschrieben , die für die Versuche angewandt wurden , wobei darauf 5 hingewiesen sei , daß die Methodik selbst bekannt, also Inhalt publizierter Arbeiten ist.
    [0012] Material und Arbeitsmethoden 0
    [0013] Als Versuchtiere für die in vivo-Versuche wurden Mäuse vom Bomholtgard, Ry, Dänemark, verwendet, und zwar in den meisten Versuchen 8 bis 12 Wochen alte Mäuse. 5
    [0014] Aktivierung von cytotoxischen Antworten in vivo
    [0015] Mäuse wurden mit 3 mg Cyclophosphamid (Endoxan, Asta, Brackwede, Deutschland) in 0,15 ml physiologischer Kochsalzlösung i.p. zwei Tage vor der Immunisierung ® behandelt. Die Immunisierung gegen trinitro- phenylierte syngeneische Zellenwurde vorgenommen, indem die Mäuse mit 6x0,01 ml 20%igem Trinitro- chlorbenzol (TNCB) in Aceton auf den vier Fußsohlen und zwei abdominalen Flächen bestrichen wurden. 5 . Die Immunisierung gegen allogene Zellen wurde durchgeführt, indem man 5x10 bestrahlte (1500 rad) allogene Milzzellen gleichmäßig in die vier Fußsohlen in einem Gesamtvolumen von 0,2 ml verteilte. Die angegebenen Mengen von L-Ornithin wurden ebenfalls 0 in die vier Fußsohlen zum Zeitpunkt der Immunisierung injiziert. Fünf Tage nach der Immunisierung wurden die Mäuse getötet ' und die Zellen der inguinalen und axilären Lymphknoten wurden direkt in einem 4-stündigen 51Cr-Release assay auf ihre cytotoxische Aktivität 5 an Con A-aktivierten Lymphoblasten als Targetzellen getestet. 1 Aktivierung von cytotoxischen. Antworten in Makro¬ kulturen
    [0016] c 20 Millionen Responderzellen (üblicherweise C3H Milz¬ zellen)wurden mit 1x10 bestrahlten (1500 rad) allogenen oder trinitrophenylierten syngenen Stimulatorzellen in einem Gesamtvolumen von 4,5 ml Kulturmedium (RPMI a'l640, GIBCO Medium supplementiert mit 10mM L-Gutamin 0 (GIBCO) , Streptomycin/Penicillin (GIBCO) , Streptomycin/ Penicillin (GIBCO; 100 units/ml) , 0,5 % HEPES (GIBCO), 10% fötalem Kälberserum (GIBCO) und 3x1θ"5 Mol/1 2-Mercaptoäthanol) 5 Tage bei 37°C in 5% CO-. incubiert. Responder-und Stimulatorzellen waren Milzzellen.
    [0017] P- Die Kulturen wurden nach 5 Tagen auf cytotoxische Aktivität gegen Con A-aktivierte allogene oder trinitrophenylierte syngene Milzlyπphoblasten in. einem 4-Stunden 51Cr-Release assay in bekannter Weise getestet. 0
    [0018] Aktivierung von cytotoxischen Antworten in Gegen¬ wart von IL-2-haltigen Zellüberständen in Mikro- kulturen. 5
    [0019] 4 C3H-Milzzellen (5x10 ) wurden als Responderzellen in 3x10 trinitrophenylierten und bestrahlten
    [0020] (1500 rad) C3H-Milzzellen und den angegebenen
    [0021] Mengen von IL-2-haltigen EL-4-überstand in 0,2 ml 0
    [0022] Mikrokulturen incubiert. Die cytotoxische Aktivität
    [0023] 4 gegen 2x10 trinitrophenylierte Con-A-aktivierte
    [0024] C3H-Milzzellenblastenwurde nach 5 Tagen in einem
    [0025] 4-Stunden 51Cr-Release assay in bekannter Weise getestet. 5 Assay der DNA-Synthese
    [0026] Die DNA-Synthese in Mikrokulturen wurde durch Zugabe von 1μCi von 3H-Thymidin pro 0,2 ml Kultur bestimmt.
    [0027] Die Mikrokulturen wurden üblicherweise weitere 8 h inkubiert und dann mit einem SCATRON-Cell-Harvester
    [0028] (Flow Laboratories) geerntet und die Filter wurden in einem Flüssigkeitsscintillationszähler gezählt. Jeder
    [0029] Punkt wurde in Vierfachbestimmung gemessen, wenn nicht anders angegeben.
    [0030] Bestimmung der Interleukin-2-Aktivität
    [0031] Die IL 2 Titer wurden mit der IL 2 abhängigen W-2 T-Zell- linie • in bekannter Weise bestimmt.
    [0032] Assay für die Interferon-Aktivität
    [0033] Interferon-Titrationen wurden unter Verwendung eines Mikrotiterassays mit L 929-Zellen (0,2 ml Medium (RPMI 1640 + 5% FKS) pro Loch) und Vesicular tomatitis Virus (Indiana-Stamm) als provozierendem Virus durchgeführt. Eine Einheit entspricht der minimalen Menge Interferon, die 50% der Zellen Schutz verleiht. Eine Mikrotiterein- heit pro 0,2 ml entspricht 2 NIH Referenzeinheiten pro ml. Alle Titer sind in Laboreinheiten ausgedrückt.
    [0034] Herstellung von IL 2-haltigen Überständen
    [0035] Die überstände werden aus einer IL-2 produzierenden EL-4 Thymom-Sublinie nach Induktion mit Phorbolmyristinacetat g (PMA) in bekannter Weise erhalten. Es wurden 10 EL-4
    [0036] Zellen pro ml zusammen mit 10 ng/ml PMA (SIGMA) 48 h inkubiert. Die überstände wurden gesammelt und bei
    [0037] -20°C gefroren gelagert. 1
    [0038] Die folgenden Beispiele zeigen die Ergebnisse und erläutern die Erfindung.
    [0039] 5 Beispiel 1 : Supprimierende Wirkung von Ornithin auf cytotoxische Antworten in vivo und in vitro (Fig. 1)
    [0040] 3H Mäuse erhielten 3 mg Cyclophosphamid in 0,15 ml physiologischer Kochsalzlösung i.P. zwei Tage 0 vor der Immunisierung. Die Immunisierung gegen tirinitro- phenylierte syngeneische Zellen wurde wie im Abschnitt Arbeitsmethoden beschrieben, durchgeführt. Sofort nach der Immunisierung wurden 4xC,05 ml physiologische Kochsalzlösung mit den in Fig. 1 angegebenen Konzen-
    [0041] •]_5 trationen von Ornithin in die vier Fußsohlen injiziert. Die Mäuse wurden fünf Tage später getötet und die cytotoxische Aktivität der gepoolten inguinalen und axillaren Lymphknotenzellen gegen 51Cr-markierte tri¬ nitrophenylierte C3H Targetzellen wurde bei dem
    [0042] 20 angegebenen Angreifer: Ziel-Zellen-Verhältnis getestet.
    [0043] Der Effekt in vitro (mittlere und rechte Zeichnung der Fig. 1) wurde wie folgt bestimmt:
    [0044] C3H Milzzellen (2 x 10 ) wurden 5 mit 1 x 10 bestrahlten und Trinitrophenylen-behandelten C3H Milzzellen (Mitte) oder 1 x 106 bestrahlte C57BL/6 Milzzellen (rechts) und mit den angegebenen Endkonzen¬ trationen von Ornithin in 4,5 ml Kulturen 5 Tage in¬ kubiert. Die cytotoxische Aktivität gegen die ent- Q sprechenden Targetzellen wurde nach 5 Tagen getestet.
    [0045] 5 Beispiel 2 : Effekt von steigenden Dosen von
    [0046] L-Ornithin auf die cytotoxische Antwort in vivo (Fig. 2)
    [0047] C3H Mäuse wurden mit Cyclophosphamid behandelt und mit Tri- nitrochlorbenzol immunisiert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Sofort nach der Immunisierung wurden 4 x 0,05 ml BSS mit steigenden Konzentrationen von Ornithin in die vier Fußflächen injiziert. Nach 5 Tagen wurde die cytotoxische Aktivität der gepoolten inguinellen und axillaren Lymphknotenzellen gegen Trinitrophenylen- behandelte C3H Targetzellen bei Angreifer: Ziel-Zellen- Verhältnissen von 50:1, 10:1 und 2:1 getestet. Figur 2 zeigt die relative cytotoxische Aktivität beim Angreifer: Ziel-Zellen- Verhältnis von 50:1 (die Kontrollantwort ohne Ornithin zeigte 32% der spezifischen Cr-release) .
    [0048] Beispiel 3: Effekt von steigenden Dosen Ornithin auf die cytotoxische Antwort in vitro (Fig. 3)
    [0049] C3H ..'.ilzzellen (2 x 107) wurden mit 1 x 10β bestrahlten und Trinitrophenylen-behandelten C3H Milzzellen (links) oder 1 x 10 bestrahlten C57BL/6 Milzzellen (rechts) in 4,5 ml Kulturen 5 Tage inkubiert. Am Tag 0, Tag 1 oder Tag 3 wurde den Kulturen 0,2 ml Kulturmedium mit steigenden Konzentrationen von L-Ornithin zugesetzt. Die Abszisse zeigt die Endkonzentration von Ornithin in der Kultur. Die cytotoxische Aktivität gegen die ent¬ sprechenden Targetzellen wurde nach 5 Tagen bei Angreifer: Ziel-Zellen-Verhältnissen von 25:1, 5:1 und 1:1 unter¬ sucht. Figur 3 zeigt die relative cytotoxische Aktivität'beim Angreifer: Siel-Zellen-Verhältnis 25:1. (Die Kontrollantwort ohne Ornithin zeigte 54% (links) bzw. 50% (rechts) Cr-release) . Beispiel 4: Wirkung von Ornithin auf die cyto¬ toxischen Antworten von Mikrokulturen in Gegenwart von IL-2-haltigern EL-4 Überstand (Fig. 4)
    [0050] C3H Milzzellen (5 x 104) wurden mit 3 x 105 bestrahlten
    [0051] (1500 rad) Trinitrophenylen-behandelten C3H Milzzellen und
    [0052] 0,015 ml EL-4 Überstand (2 units IL-2) inkubiert. Die
    [0053] Kulturen wurden am Tag 0, Tag 1 oder Tag 3 mit 0,02 ml Kulturmedium mit steigenden Konzentrationen von L-
    [0054] Ornithin ergänzt. Die Abszisse von Fig. 4 gibt die'Endkonzen- tration von Ornithin in den Kulturen an. Die cytotoxische
    [0055] Aktivität gegen TNP-Hapten-behandelte syngene Targetzellen
    [0056] 4 (2 x 10 pro Loch) wurde am Tag 5 getestet. (Die Kontroll- antwort zeigte 54% bei Cr-Freisetzung)
    [0057] Es zeigt sich somit, daß Ornithin eine starke suppressive Wirkung auf in vivo- und in vitro-cytotoxische Antworten gegen haptenierte syngene und allogene Targetzellen auc- übt (Fig. 1) . Die cytotoxische Antwort von Cyclophosphamid behandelten C3H Mäusen gegen allogene C57BL/6 Zellen in vivo war immer, von vornherein, bereits relativ schwach, wurde jedoch ebenfalls durch Injektion von L-ornithine supprimiert. Die Dosiswirkungs- kurven für die Effekte von Ornithin in vivo und in vitro sind in den Figuren 2 bzw. 3 gezeigt. Die Figur 3 zeigt auch, daß die Suppression ausgeprägter ist, wenn Ornithin in der frühen Phase, d.h. am Tag 0 oder Tag 1, zugesetzt wird, als am Tag 3 der cytotoxischen Antwort. Der suppressive Effekt wird nicht mit den Strukturanalogen
    [0058] L-Lysin und Putrescin oder mit den Aminosäuren L-Histidin und L-Alanin beobachtet , wie Tabelle I zeigt. 1 TABELLE I
    [0059] Effekt von verschiedenen Aminosäuren und Putrescin auf die Aktivierung von cytotoxischen T-Lymphocyten
    [0060] Stimulans und Tarσet
    [0061] TNP-C3H C573L/6
    [0062] 25:1 5:1 1:1 25:1 5:1 1:
    [0063] Keine 54,9 32,0 16,3 33,5 17,7 4,
    [0064] L-Ornithin 7,9 3,7 3,2 1 ,8 -1 ,7 -0,
    [0065] L-Lysin 60,7 39,9 21 ,5 41 ,7 19,1 9,
    [0066] L-Hystidin 48,5 27,8 11 ,1 24,5 11 ,4 5,1
    [0067] L-Alanin. 40,5 25.3 9,8 . • 19,2 5,3 6,
    [0068] Putrescin 44,2 24,8 9,6 30,2 11 ,9 7,
    [0069] C3H Milzzellen (2 x 10 7) wurden mit 5 x 106 bestrahlten trinitrophenylierten C3H Milzzellen oder C57BL/6 Milz- 5 zellen in 5 ml der Kulturen inkubiert, die zusätzlich zu den Standardmedienbestandteilen die angegebenen Amino- sauren oder Putrescin in Konzentrationen von 1 x 10 —2 mol/1 enthielten. Die Ergebnisse geben die cytotoxische
    [0070] Aktivität (% Cr-Freisetzung) gegen homologe Target- 0 zellen nach 5 Tagen bei Angreifer:Targetzellen-Verhältnissen von 25:1, 5:1 und 1:1 an.
    [0071] 5 1
    [0072] Um zu unterscheiden, ob Ornithin die Aktivierung von CTL-
    [0073] Precursorzellen direkt oder nur indirekt durch die Hemmung von Helper-T-Zellen hemmt, wurden die Experimente in 5 IL-2-hal i^en Mikrokulturen durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Beispiele (Fig. 4) machten offenbar, daß Ornithin einen starken suppressiven Effekt auch auf cytotoxische Antworten in IL-2-haltigen Kulturen ausübt. Die Suppressions- wirkung war wiederum ausgeprägter, wenn Ornithin am Tag 0 Q oder Tag 1 zugesetzt wurde, als wenn es am Tag 3 der Kultur geschah.
    [0074] Die Applikation des ornithinhaltigen Mittels wird somit zweckmäßig so erfolgen, daß der gewünschte Ornithinspiegel am Tage Null, also bei der Operation, zur Verfügung steht.
    [0075] Beispiel 5: Wirkung von L-Ornithin auf die. Produktion von Interleukin-2 und -Interferon (Fig. 5) 0
    [0076] η C3H Milzzellen (1 x 10 /ml) wurden mit Conacanavalin A
    [0077] (5 μg/ml) und den angegebenen Endkonzentrationen von L-Ornithin für 24 h in 4 ml Makrokulturen inkubiert. 5 Die resultierenden Überstände wurden dann durch Zentri- fugation isoliert und auf Interleukin-2 und Interferon- Aktivität getestet, wie im Methodenteil beschrieben. Die Interleukin-2-Produktion von PMA-aktivierten EL-4 Thymo zellen wurde ebenfalls untersucht und war durch 0 diese Konzentrationen von L-Ornithin ebenfalls nicht supprimiert.
    [0078] 5 Die Konzentration von 9 x 10 mol/1 L-Ornithin, von der gefunden wurde, daß sie die cytotoxischen Antworten voll¬ ständig supprimiert,hat also keinen wesentlichen Effekt auf die Produktion von IL-2 und IFN- V (Fig. 5) . Ansteigende Konzentrationen von Ornithin wurden Kulturen von con-A- aktivierten Konzentrationen von Ornithin C3H Milzzellen (10 Zellen + 5 μg con-A pro ml) zugesetzt. Die erhaltenen
    [0079] Überstände wurden 24 h später isoliert und auf Inter- leukin-2 und Interferonaktivität getestet. Die Ergebnisse (Fig. 5) zeigen, daß die Produktion beider Lymphokin- Aktivitäten nicht merklich durch den Zusatz von Ornithin beeinträchtigt wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden bezüglich der IL-2 und IFN-Y -Titer nach 48 h Kultur und außerdem auch bezüglich der IL-2-Titer in ornithinhaltigen Kulturen von Phorbolmyristinacetat aktivierten EL-4 Thymomazellen gefunden. C3H 'Milzzellkulturen mi 1 μg/ml con-A sowie allogene l'Gemischte-Ly-nphozyten-Kulturen,, mit 10 nicht-bestrahltenC3H Milzzellen plus 10 nicht- bestrahltenC57BL/6 Milzzellen wurden eben¬ falls mit steigenden Konzentrationen von Ornithin ange¬ setzt. Ihre Überstände zeigten jedoch unabhängig von der Menge des zugesetzten Ornithins keine IL-2 oder Interferon- Aktivität . Kontroilösungen, die steigende Mengen von Ornithin im Kulturmedium enthielten, zeigten ebenfalls keine Lymphokin-Aktivitäten in den beiden Assay-Systemen . Diese Kontrollversuche zeigten, daß Ornithin selbst keine Interleukin-2 oder Interferon-Aktivität aufweist und die Lymphokin-Produktion in Lymphozycten-Kulturen nicht induziert. Außerdem hat Ornithin keinen verstärkenden oder hemmenden Effekt auf die beiden Assay-Systeme. Beispiel 6 : Wirkung von Ornithin auf proliferative Antworten
    [0080] Das folgende Beispiel zeigt die Wirkung von Ornithin auf drei Typen von proliferativen T-Zellantworten. Zunächst wurden "Gemischte-
    [0081] Lymphozyten-Kulturen" mit 3 x 1 0 5 CH3 Milzzellen und 3 -x 1 05 bestrahlten ( 1500 rad) C57BL/6 Milzzellen als Stimulator¬ zellen mit oder ohne Zusatz von 0 , 15 ml EL-4-überstand (2 units IL-2 pro Kultur) mit steigenden Dosen von L- Ornithin inkubiert . Die Ergebnisse (Fig. 6 ) zeigen , daß
    [0082] Ornithin bei allen getesteten Konzentrationen keine W Wiirrkkuunngg aauuff ddjie Antwort der DNA-Synthese ( H-Thymidin- Einbau) zeigt.
    [0083] Fig. 6 zeigt die Wirkung von L-Ornithin auf die prolifera¬ tive Antwort in der allogenen mixed Lymphozytkultur (LMC) , wobei C3H Milzzellen (3 X10 ) mit 3 x 105 bestrahlten (1500 rad) C57BL/6 Milzzellen mit oder ohne Zusatz von 0,015 ml EL-4 überstand in 0,2 ml Mikrokulturen inkubiert wurden. Die DNA-Synthese wurde nach 3 und 5 Tagen bestimmt, wie im Methodenteil beschrieben.
    [0084] Beispiel 7
    [0085] In einem weiteren Beispiel wurden C3H Thymocyten (1 x 10" Zellen)mit IL-2 (2 units pro Kultur) und steigenden Konzen¬ trationen von Concanvalin A und L-Ornithin in 0,2 ml Mikrokulturen inkubiert. Die Ergebnisse (Fig. 7) zeigen wiederum, daß Ornithin keinen Effekt auf die DNA-Synthese der reagieren¬ den Lymphozyten zeigte.
    [0086] Die Fig. 7 zeigt die Wirkung von Ornithin auf die Mitogenstimmulierung von Thymocyten durch Concanävalin A, wobei C3H Thymuszellen (1 x 10 ) mit den angegebenen Mengen von Concanävalin A und mit 2 Einheiten IL-2 und den angegebenen Konzentrationen von L-Ornithin in 0,2 ml Mikrokulturen inkubiert wurden. Die DNA Synthese wurde nach 3 Tagen, wie im Methodenteil beschrieben, getestet,
    [0087] Beispiel 8
    [0088] 4 In diesem Beispiel wurden 10 Zellen des W-2 T-Zellklons mit Interleukin-2 (0,5 units pro Kultur) und steigenden Dosen von L-Ornithin in 0,2 ml Mikrokulturen 20 h bei 37°C inkubiert. Die W-2-Zellen wurden dann für die DNA- Synthese untersucht, wie für den Interleukin-2 Assay beschrieben (Methodenabschnitt) . Wiederum hatte Ornithin keine Wirkung auf die DNA-Synthese dieses T-Zellklons.
    [0089] Figur 8 zeigt die Wirkung von L-Ornithin auf die IL-
    [0090] 2-abhängige DNA-Synthese des T-Zellklons W-2, wobei
    [0091] 4 Zellen des T-Zellklons W-2 (10 ) mit Interleukin-2
    [0092] (0,5 Einheiten) und steigenden Konzentrationen von
    [0093] L-Ornithin in 0,2 ml Mikrokulturen für 20 h inkubiert wurden. Die Kulturen wurden dann auf ihre DNA-Synthese untersucht, wie im Interleukin-2 Assay im Methodenteil beschrieben.
    [0094] Die Beispiele zeigen somit, daß L-Ornithin eine starke immunosuppressive Wirkung auf die Aktivierung cytotoxi- scher T-Lymphozyten in vivo und in vitro hat. Andererseits hat Ornithin in ähnlichen Konzentrationen keine Wirkung auf die Erzeugung von Interleukin-2 oder /^Interferon durch con-A-aktivierte C3H Milzzellen oder PMA- aktivierte EL-4 Thymomazeilen. Es hat weiterhin keine Wirkung auf viele Typen proliferativer Reaktionen, einschließlich der allogenen "Gemischten-Lymphozyten-Re--ktion11, die IL-2-abhängige proliferative Antwort von con-A- aktivierten Thymocyten und die IL-2-abhängige Pro- liferation des W-2 T-Zellklons. Dies weist darauf hin, daß L-Ornithin bei den benutzten Konzentrationen keinen allgemeinen toxischen Effekt auf die reagierenden Zeil- populationen hat, sondern einenselektiven immunsuppressiven Effekt auf die Aktivierung der CTL-Precursorzellen aus¬ übt. Dies wird außerdem durch die Tatsache gestützt, daß die cytotoxischen Antworten stark supprimiert wurden, wenn Ornithin während der ersten zwei Tage der Reaktion zugesetzt wurde, jedoch wesentlich weniger gehemmt waren, wenn Ornithin am Tag 3 zugesetzt wurde. L-Ornithin scheint somit die zelluläre Immunantwort auszuschalten, ohne die unerwünschten Nebenwirkungen von Cyclosporin A zu zeigen.
    权利要求:
    ClaimsPatentansprüche
    1. Verwendung von L-Ornithin für die Herstellung von
    Mitteln zur selektiven Hemmung von T-Zell vermittelten
    Immunreaktionen.
    2. Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung von Mitteln zur selektiven Hemmung der Aktivierung von cytotoxischen T-Lymphozyteneffektorzellen.
    3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß L-Ornithin in einer Menge von 0,1 bis 1 g/kg Körpergewicht eingesetzt wird.
    4. Mittel zur selektiven Hemmung von T-Zell vermittelten Immunreaktionen, insbesondere zur selektiven Hemmung der Aktivierung von cytotoxischen T-Ly_nphozyt"en- effektorzellen bestehend aus L-Ornithin, gelöst in physiologischer Kochsalzlösung oder pyrogenfreiem Wasser oder in Form von üblichen Oralpräparaten mit üblichen Hilfsstoffen.
    5. Mittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß L-Ornithin in einer Konzentration von 0,1 bis 1 mol/1 Trägerflüssigkeit vorliegt.
    6. Verfahren zur selektiven Hemmung von T-Zell ver¬ mittelten Immunreaktionen, insbesondere zur selektiven Hemmung der Aktivierung von cytotoxischen T-Lympho¬ zyteneffektorzellen, dadurch gekennzeichnet, daß man Ornithin, gelöst in physiologischer Kochsalzlösung oder pyrogenfreiem Wasser oder als Oralpräparat, insbesondere Tabletten oder Kapseln, in einer pysiologisch wirksamen Menge oral oder parenteral verabreicht. ■46 '
    7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß L-Ornithin in einer Menge von 0,1 bis 1 g/kg Körpergewicht eingesetzt wird.
    8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß L-Ornithin in einer Konzentration von 0,1 bis 1 mol/1 Trägerflüssigkeit eingesetzt wird.
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    AU5694386A|1986-11-18|
    DE3514328C1|1986-09-11|
    EP0199291A1|1986-10-29|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1986-11-06| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AU DK FI HU JP KR NO US |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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